PCR 全称聚合酶链式反应，它是一种在体外对特定 DNA 片段进行指数级扩增的分子生物学技术，核心原理是利用温度循环变化，依靠热稳定 DNA 聚合酶，让目的 DNA 片段不断复制，经过几十轮循环之后，微量的原始模板 DNA 可以扩增出大量拷贝，整个 PCR 的具体过程不是一次性反应，而是由变性退火延伸三个基础阶段反复循环构成，同时还包含反应体系配制上机设置循环参数产物检测这些完整实验环节，这项技术广泛用在病原检测基因鉴定克隆实验等场景，PCR 之所以可以实现指数扩增，是因为每一轮新合成的 DNA 链，在下一轮又会变成模板，循环次数越多目的产物浓度越高，做 PCR 实验的时候，体系组分引物浓度酶量镁离子浓度退火温度循环数这些参数都会直接影响扩增效果，容易出现非特异性条带引物二聚体扩增失败等问题，理解 PCR 的具体过程，才能理解参数调整和实验异常的底层原因。

PCR 反应体系基础组分

PCR 的具体过程完整操作

第一步 反应体系配制，在冰上按照实验方案，依次加入去离子水缓冲液镁离子 dNTP 上下游引物 Taq 酶模板 DNA，配制的时候尽量低温操作，防止引物提前结合或者酶提前失活，配制完成之后轻轻混匀短暂离心，把液体全部收集到管底。

第二步 上机设置程序，把反应管放入 PCR 仪，设置预变性，然后设置循环阶段，循环一般设置 25 到 35 轮，循环结束之后设置终延伸，部分实验还会设置 4 摄氏度保温保存产物。

第三步 预变性阶段，温度一般设置 94 到 95 摄氏度，保持 3 到 5 分钟，这个步骤不是循环里面的三步，目的是让原始模板 DNA 充分完全解链，把双链彻底打开，同时激活部分热启动 Taq 酶。

第四步 第一轮循环开始，首先是变性，维持 94 到 95 摄氏度，持续 20 到 30 秒，双链 DNA 氢键断裂，解开变成两条单链模板。

第五步 退火阶段，温度下降到引物对应的退火温度，一般 50 到 65 摄氏度，这个温度下上下游引物可以特异性结合到单链模板对应的互补序列位置，退火温度太低容易出现非特异性结合，太高引物结合不上，扩增失败。

第六步 延伸阶段，温度升到 72 摄氏度左右，这个是 Taq 酶最适工作温度，DNA 聚合酶从引物 3 端开始，沿着模板链按照碱基互补配对，不断加入 dNTP，合成新的 DNA 链，延伸时间根据目的片段长度计算，一般 1kb 片段大约需要 1 分钟。

第七步 循环重复，变性退火延伸三步为一轮，不断重复，每完成一轮，目的 DNA 拷贝数近似翻倍，经过多轮循环之后，目的片段大量累积。

第八步 终延伸阶段，全部循环结束之后，一般在 72 摄氏度继续保持 5 到 10 分钟，让还没有合成完整的 DNA 链补齐，减少产物末端不完整的情况。

第九步 产物保存，程序结束之后，PCR 仪可以自动降温到 4 摄氏度，样品可以短期放置，后续进行琼脂糖凝胶电泳，验证 PCR 产物有没有目标大小条带，判断扩增是否成功。

PCR 关键原理与参数要点

指数扩增规律，理论上 n 轮循环之后，目的片段拷贝数是 2 的 n 次方，但是实际反应后期会进入平台期，酶活性下降原料消耗，不会无限指数增长，所以循环数不是越多越好，过多循环容易增加非特异性扩增。

引物设计影响，引物长度 GC 含量决定退火温度，引物如果有互补配对，容易形成引物二聚体，在 PCR 的具体过程里面退火阶段优先结合，消耗引物，影响主产物扩增。

热启动 PCR，属于改良 PCR，酶在低温下没有活性，升温之后才激活，可以减少室温下引物错配，提升特异性。

梯度 PCR，PCR 仪设置温度梯度，一次实验筛选最优退火温度，解决普通 PCR 特异性差的问题。

PCR 常见异常情况

无扩增条带，常见原因是退火温度过高，引物失效，模板降解，Taq 酶失活，体系漏加组分。

非特异性条带，退火温度偏低，引物特异性差，循环次数过多，镁离子浓度偏高。

引物二聚体，引物之间互补，退火阶段互相结合，电泳出现很小的杂带。

弥散拖尾，模板浓度过高，酶量过大，循环过多，产物降解。

PCR 的具体过程本质就是依靠温度切换，完成解链引物结合链延伸的重复循环，把特定 DNA 片段大量复制，预变性循环三步终延伸是标准 PCR 完整流程，实验优化核心就是调整退火温度镁离子浓度循环数，提升扩增特异性和产量，后续如果需要更高精度或者特殊检测，还可以在普通 PCR 基础上发展出实时荧光定量 PCR 巢式 PCR 等衍生类型。

【常见问题】

问题 1 PCR 的具体过程里面为什么一定要设置预变性

回答 1 PCR 的具体过程设置预变性，是为了让原始双链模板 DNA 充分解旋打开，保证后续每一轮循环变性可以顺利进行，如果是热启动 Taq 酶，预变性还可以激活酶，避免 PCR 的具体过程早期出现非特异性扩增。

问题 2 PCR 的具体过程中退火温度起什么作用

回答 2 PCR 的具体过程退火阶段，退火温度决定引物和模板结合的特异性，温度偏高引物不容易结合，会造成 PCR 扩增失败，温度偏低引物会随机结合非目标序列，PCR 的具体过程就会产生多余杂带。

问题 3 PCR 的具体过程循环次数是不是越多越好

回答 3 PCR 的具体过程循环次数不是越多越好，循环太多会进入平台期，原料和酶消耗之后扩增不再增加，还会提升非特异性扩增概率，普通 PCR 的具体过程一般选择 25 到 35 轮就足够。

问题 4 PCR 的具体过程延伸时间怎么确定

回答 4 PCR 的具体过程延伸时间主要按照目的扩增片段长度计算，Taq 酶合成速度大约每分钟 1kb，片段越长，PCR 的具体过程延伸阶段设置时间就要相应加长，时间不足会造成 PCR 产物链合成不完整。

【免责申明】

本文内容仅为 PCR 相关分子生物学技术科普讲解，不构成临床检测或者实验方案指导，真实临床 PCR 检测需要严格按照实验室规范试剂说明书以及相关质控要求执行，专业实验请由具备资质的实验人员操作。